同仁CCK8檢測(cè)步驟

1. 向各孔中加入100 μl細(xì)胞懸液。a)

2. 在37℃下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b)

3. 向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液c)10 μl。

4. 37℃下孵育。

5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。

6. 37℃下孵育1-4小時(shí)。e)

7. 測(cè)定450 nm處的OD值。

 a) 使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

b) 建議使用CO2培養(yǎng)箱過夜預(yù)培養(yǎng)。

c) 使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液。

d) 如果待測(cè)溶液有還原性，測(cè)定不含細(xì)胞，但含有CCK-8的待測(cè)溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100 μl培養(yǎng)基和10 μl CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。

e) 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。

 活力計(jì)算

細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100

A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度

A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

DOJINDO CCK8 初學(xué)者問答 (同仁DOJINDO)

1.一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞？

當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

2.能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)？

可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。

3.能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)？

可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。

4.酚紅會(huì)影響檢測(cè)嗎？

不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

5.CCK-8與胸苷結(jié)合檢測(cè)之間是否有相關(guān)性？

有。然而，請(qǐng)注意由于CCK-8使用的檢測(cè)原理與胸苷檢測(cè)的不同，因此結(jié)果可能不同。

6.CCK-8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？

可以檢測(cè)E.coli，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10 μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過夜。

7.CCK-8穩(wěn)定嗎？

CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長(zhǎng)期保存，我們推薦-20℃的儲(chǔ)藏條件。

8.如果沒有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用450nm到490nm之間的濾光片。

9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？

可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

10.CCK-8是什么顏色？

應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會(huì)影響測(cè)定。

11.CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色？

不能。因?yàn)?/span>CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

12.CCK8檢測(cè)溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒？

CCK8溶液自身因?yàn)楦邼舛鹊?/span>1Methoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?/span>10倍。因此，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8檢測(cè)后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測(cè)，如結(jié)晶紫檢測(cè)，中性紅檢測(cè)或者DNA熒光檢測(cè)等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測(cè)一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。

13.在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)測(cè)定是否有影響？如何解決？

有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有還原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，測(cè)定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

14.每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會(huì)有以下幾個(gè)原因： 1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。 2. 有可能會(huì)因?yàn)?/span>CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請(qǐng)預(yù)先在1,000100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。

15.如何設(shè)定空白對(duì)照？

在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450nm的吸光度作為空白對(duì)照。

16.哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測(cè)定？

當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測(cè)定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測(cè)定)。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測(cè)定，扣除空白吸收即可。

17.在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？

可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。

18.設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？

不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長(zhǎng)沒有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

19.說明書上僅寫了96孔板的測(cè)定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8試劑？…

一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。

20.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應(yīng)？

有一下幾種方法（96孔板）： 1、在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。

21.必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？

不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。

22.如果加入的藥物中含有金屬，是否會(huì)有影響？

金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm的話，將會(huì)100%抑制。

23.CCK-8試劑的保存條件？

在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長(zhǎng)時(shí)間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測(cè)結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。

24.預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。

25.CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。

26.懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？

懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時(shí)吸光度會(huì)超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。

27.應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

28.有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量？…

不能。由于CCK-8是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量將會(huì)比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測(cè)定。

29.實(shí)驗(yàn)之前，是否需要先檢測(cè)一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會(huì)反應(yīng)？

建議使用一個(gè)孔作一下檢測(cè)，因?yàn)橛信囵B(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實(shí)驗(yàn)之前有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常在的OD值應(yīng)該在0.4以下。