同仁CCK8操作說(shuō)明與檢測(cè)步驟(附初學(xué)者問(wèn)答)
細(xì)胞活性檢測(cè)
1. 在96 孔板中接種細(xì)胞懸液 (100 ml /孔 ) 。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) (在37 ℃,5% CO2的條件下 )。
2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡,它們會(huì)影響 O.D值的讀數(shù)) 。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時(shí)。
4. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
5. 如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值,打算以后測(cè)定的話(huà),可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
細(xì)胞增殖 -毒性檢測(cè)
1. 在96 孔板中配制 100 ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24小時(shí) ( 在37℃, 5% CO2的條件下 )。
2. 向培養(yǎng)板加入10 ml不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 (例如: 6,12, 24 或48小時(shí) )。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成氣泡,它們會(huì)影響 O.D值的讀數(shù)) 。
5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時(shí)。
6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
7. 如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值,打算以后測(cè)定的話(huà),可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
注意:如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà),可在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基,去掉藥物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基,直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
1. 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,然后接種細(xì)胞。
2. 按比例 ( 例如:1/2比例 ) 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度,一般要做 3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度,每組3-6個(gè)復(fù)孔。
3. 接種后培養(yǎng)2-4 小時(shí)使細(xì)胞貼壁,然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定 O.D值,制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo) (X軸) ,O.D值為縱坐標(biāo) (Y軸) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量 (使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致,便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間)。
同仁CCK8檢測(cè)步驟
1. 向各孔中加入100 μl細(xì)胞懸液。a)
2. 在37℃下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b)
3. 向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液c)10 μl。
4. 37℃下孵育。
5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。
6. 37℃下孵育1-4小時(shí)。e)
7. 測(cè)定450 nm處的OD值。
a) 使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。
b) 建議使用CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。
c) 使用培養(yǎng)基或PBS來(lái)制備溶液。
d) 如果待測(cè)溶液有還原性,測(cè)定不含細(xì)胞,但含有CCK-8的待測(cè)溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小,則可以直接加入CCK-8 ,如果吸光度相對(duì)較大,則需要除去培養(yǎng)基,并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,然后加入新的100 μl培養(yǎng)基和10 μl CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。
e) 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。
活力計(jì)算
細(xì)胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100
A(加藥):具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度
A(0加藥):具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度
*細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
DOJINDO CCK8 初學(xué)者問(wèn)答 (同仁DOJINDO)
1.一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞?
當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí),貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低,因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn),請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量,并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。
2.能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)?
可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液,如果加入的CCK-8體積太少,可以先將CCK-8溶液稀釋1倍,然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。
3.能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)?
可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。
4.酚紅會(huì)影響檢測(cè)嗎?
不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí),通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
5.CCK-8與胸苷結(jié)合檢測(cè)之間是否有相關(guān)性?
有。然而,請(qǐng)注意由于CCK-8使用的檢測(cè)原理與胸苷檢測(cè)的不同,因此結(jié)果可能不同。
6.CCK-8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞?
可以檢測(cè)E.coli,但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10 μl CCK-8溶液,并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。
7.CCK-8穩(wěn)定嗎?
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月,在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長(zhǎng)期保存,我們推薦-20℃的儲(chǔ)藏條件。
8.如果沒(méi)有450nm的濾光片,還可以使用哪些其他濾光片?
還可使用450nm到490nm之間的濾光片。
9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來(lái)的誤差?
可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。
10.CCK-8是什么顏色?
應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣,有可能會(huì)影響測(cè)定。
11.CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色?
不能。因?yàn)?/span>CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8),并通過(guò)電子載體1Methoxy PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。
12.CCK8檢測(cè)溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒?
CCK8溶液自身因?yàn)楦邼舛鹊?/span>1Methoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是,加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒(méi)有毒性的,因?yàn)楸幌♂屃?/span>10倍。因此,長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng),如過(guò)夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8檢測(cè)后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測(cè),如結(jié)晶紫檢測(cè),中性紅檢測(cè)或者DNA熒光檢測(cè)等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK8的耐受力都不同,因此在需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí),先檢測(cè)一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。
13.在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí),藥物對(duì)測(cè)定是否有影響?如何解決?
有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有還原性,會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng),增加吸光度。解決辦法:首先要確認(rèn)藥物是否有吸收,在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8,測(cè)定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基,去掉藥物的影響。
14.每次測(cè)定的數(shù)值不一樣,是什么原因?如何解決?
可能會(huì)有以下幾個(gè)原因: 1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā),由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下,最外一圈的孔只加培養(yǎng)基,不作為測(cè)定孔用。 2. 有可能會(huì)因?yàn)?/span>CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差,建議在加入CCK8后,輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過(guò)多或過(guò)少。請(qǐng)預(yù)先在1,000100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。
15.如何設(shè)定空白對(duì)照?
在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時(shí)間,測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí),還應(yīng)考慮藥物的吸收,可在不含細(xì)胞,加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時(shí)間,測(cè)定450nm的吸光度作為空白對(duì)照。
16.哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測(cè)定?
當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測(cè)定,例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多,酚紅或血清不影響測(cè)定)。在有酚紅存在的情況下,會(huì)增加空白吸收,但不影響測(cè)定,扣除空白吸收即可。
17.在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高,如果不能減少細(xì)胞數(shù)量,如何解決?
可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如:可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。
18.設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么?必須設(shè)定嗎?
不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長(zhǎng)沒(méi)有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來(lái)的吸收。
19.說(shuō)明書(shū)上僅寫(xiě)了96孔板的測(cè)定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應(yīng)該加多少量CCK-8試劑?…
一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。
20.在CCK-8顯色過(guò)程中,如何終止反應(yīng)?
有一下幾種方法(96孔板): 1、在顯色反應(yīng)后,將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應(yīng)停止后,應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。
21.必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎?
不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài),建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng),細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng),但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。
22.如果加入的藥物中含有金屬,是否會(huì)有影響?
金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng),使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm的話(huà),將會(huì)100%抑制。
23.CCK-8試劑的保存條件?
在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長(zhǎng)時(shí)間的話(huà),推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收,從而影響檢測(cè)結(jié)果,若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。
24.預(yù)培養(yǎng)后,更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎?
一般情況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞,用血球計(jì)數(shù)盤(pán)計(jì)數(shù),制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話(huà),可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤(pán)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
25.CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞,靈敏度是否一樣?
不一樣,懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞,一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高,但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低,可以通過(guò)延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。
26.懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別?
懸浮細(xì)胞由于染色比較困那,一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容易,若細(xì)胞數(shù)量過(guò)大,有時(shí)吸光度會(huì)超過(guò)酶標(biāo)儀的讀數(shù)。
27.應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)嗎?
建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的,但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣,對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞,建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果試劑的批號(hào)不一樣,靈敏度可能會(huì)有輕微的差異,對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
28.有時(shí)在藥物作用情況下,細(xì)胞已經(jīng)死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量?…
不能。由于CCK-8是通過(guò)和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量,如果細(xì)胞已經(jīng)死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量將會(huì)比真實(shí)值高,不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量,建議采用別的方法測(cè)定。
29.實(shí)驗(yàn)之前,是否需要先檢測(cè)一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會(huì)反應(yīng)?
建議使用一個(gè)孔作一下檢測(cè),因?yàn)橛信囵B(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì),在正式實(shí)驗(yàn)之前有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常在的OD值應(yīng)該在0.4以下。