|
為了準確地進行基因表達量分析，必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但Total RNA中常常混有基因組DNA，并可以直接作為PCR反應的模板進行擴增，因此會造成解析結果不準確。為了避免這種情況發(fā)生，通常將檢測用引物設計在內(nèi)含子前后的外顯子上，使基因組DNA得不到擴增。但是，此方法不適合具有單個外顯子的基因或兩個外顯子之間所跨的內(nèi)含子過小的基因，同時當基因組上有偽基因存在時、或設計引物對基因組有非特異性擴增時、以及基因信息沒被完全解析的生物種等也同樣不適合于本方法。在這種情況下，我們常常需要對Total RNA樣品進行DNase I處理，以除去殘存的基因組DNA。而DNase I處理通常要進行復雜的純化操作，同時會造成RNA的降解和損失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因組DNA進行Real Time RT-PCR反應的專用反轉錄試劑。Kit中使用了具有較強DNA分解活性的gDNA Eraser，通過42℃，2 min即可除去基因組DNA。同時由于反轉錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分，經(jīng)過gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進行15 min的反轉錄反應合成cDNA，因此，20 min內(nèi)即可迅速完成從基因組DNA去除到cDNA合成的全過程。
使用本制品合成的cDNA適用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探針分析法，可以根據(jù)實驗目的，選擇與SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)、Premix Ex Taq (Probe qPCR) 等定量試劑組合使用。
注意：Takara Bio使用SYBR® Green I 作為研究試劑已得到Molecular Probes Inc.的許可。SYBR®為 Molecular Probes Inc.的注冊商標。
|
| |
| ■ 保存 |
-20℃。
|
| |
| ■ 試劑盒特長 |
|
1. 含有去除基因組DNA的gDNA Eraser，只需2 min即可除去基因組DNA。
2. 只需15 min即可高效合成Real Time PCR反應用模板cDNA，是進行2 Step Real Time RT-PCR反應的******試劑。
3. 反轉錄引物使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer混合的RT Primer Mix，可以均勻合成樣品中的各種cDNA。
4. 本制品提供了SYBR Green®分析法和TaqMan®探針分析法各自最適反應體系，可以根據(jù)分析方法選擇體系。?
(1) 反轉錄反應中RT Primer Mix的用量。 ?
(2) 反轉錄反應中總RNA的用量。
|
| |
| 5. Real Time RT PCR定量需要建立標準曲線，建立標準曲線的條件就是需要將總RNA和反轉錄cDNA稀釋到較低的濃度。如果用 |
| 水或TE Buffer稀釋時，由于模板濃度低不穩(wěn)定，因而會縮小曲線范圍，結果精度降低。本制品中附加了標準曲線制作用稀釋液 |
| EASY Dilution (for Real Time PCR) ，將Total RNA或cDNA稀釋至低濃度時也能夠進行準確稀釋，容易在寬廣范圍內(nèi)獲得準確 |
| 定量的標準曲線。 |
| |
| ■ 注意事項 |
|
1. 當同時需要進行數(shù)次反應時，應先配制各種試劑的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、酶等)，然后再
|
| 分裝到每個反應管中。這樣可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重復分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或 |
| 實驗之間產(chǎn)生的誤差。 |
| 2. gDNA Eraser和PrimeScript® RT Enzyme Mix I 在使用前要小心地離心收集到反應管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油， |
| 粘度高，分取時應慢慢吸取。同時，要使用精確、量程適合的移液槍，并且不要使Tip插入液面過深，否則會因Tip壁粘著造成 |
| 損失，而使酶量不足。 |
3. 5×gDNA Eraser Buffer和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 在使用前需Vortex輕輕離心。
4. 分裝試劑時務必使用新的槍頭 (Tip)，以防止樣品間污染。 |
北京
